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Apr 21, 2023

Lipidspeicher verraten den Zustand der Koralle

ISME Communications Band 3,

ISME Communications Band 3, Artikelnummer: 29 (2023) Diesen Artikel zitieren

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Weltweit sind Korallenriffe durch Umweltstress bedroht. Der beobachtbare Rückgang der Korallenbedeckung ist hauptsächlich auf den zunehmenden Zusammenbruch der Korallensymbiose zurückzuführen, ein Prozess, der als „Bleichen“ bekannt ist. Die Überproduktion reaktiver Sauerstoffspezies (ROS) gilt als Hauptursache für die Korallenbleiche, bei der Umweltstress zu einer erhöhten ROS-Expression führt. Um den Zusammenhang zwischen ROS-Schäden und Symbiontenstatus zu untersuchen, haben wir die Lipidperoxidation (LPO), eine allgegenwärtige Form von ROS-Schäden, in den Lipidspeichern einzelner endo- und ex-symbiotischer Algenzellen von drei Korallenarten mithilfe konfokaler Mikroskopie gemessen Lipidhydroperoxid-empfindlicher Fluoreszenzfarbstoff. Wir fanden heraus, dass LPO bei Endosymbionten höher war, während das Lipidvolumen in ex-symbiotischen Zellen größer war. Die Clusteranalyse ergab drei Stoffwechselprofile, die endosymbiotische (Nr. 1: hoher LPO, niedriger Lipidgehalt) und ex-symbiotische Zellen (Nr. 3: niedriger LPO, hoher Lipidgehalt) unterscheiden, wobei die Zwischengruppe (Nr. 2) beide Zelltypen enthält. Hitzestress führte dazu, dass sich Endosymbionten von Pocillopora acuta von Cluster Nr. 1 entfernten, was darauf hindeutet, dass dieser Cluster Zellen in gesunder/stabiler Symbiose darstellt. Unsere Studie liefert ein neues Mittel zur Beurteilung der Korallensymbiose und zeigt, dass das LPO-Verhältnis des Symbionten in Kombination mit dem Lipidspeichervolumen ein robuster Stoffwechselmarker für den Zustand der Symbiose auf zellulärer Ebene ist.

Skleraktinische Korallen bilden das Fundament von Korallenriffen und verdanken ihren ökologischen Erfolg ihrer Interaktion mit einzelligen symbiotischen Algen [1] aus der Familie der Symbiodiniaceae [2]. Die intrazelluläre Beziehung zwischen der Alge und ihrem Wirt ermöglichte es den Korallen seit über 200 Millionen Jahren, in den nährstoffarmen Gewässern der Tropen zu gedeihen [3]. In der Symbiose versorgt der Nesseltierwirt die Alge mit reduziertem Stickstoff und anderen Nährstoffen, die aus seinem heterotrophen Lebensstil stammen, während der Algensymbiont den Stoffwechsel des Wirts unterstützt, indem er photosynthetisch produzierten Kohlenstoff bereitstellt [4,5,6]. Aufgrund der Komplexität dieser Beziehung und der bis vor kurzem [7] fehlenden Möglichkeit, In-vitro-Experimente an einzelnen funktionellen symbiotischen Einheiten (d. h. intakten Wirtszellen mit Endosymbionten) durchzuführen, ist unser Wissen über die grundlegenden zellulären Mechanismen, die die symbiotischen Interaktionen aufrechterhalten, einschließlich diejenigen, die die selektive Austreibung von Algensymbionten (unabhängig davon, ob sie durch den Wirt oder den Symbionten initiiert werden) aus dem Wirtsgewebe unterstützen [1, 8], fehlen noch.

Als Teil eines Kosten-Nutzen-Regulierungsmechanismus [9] kontrollieren Korallen die Dichte der Symbionten im Gewebe, indem sie ihre Wachstumsrate einschränken, möglicherweise durch Stickstoffbegrenzung [10], und indem sie überschüssige Symbiontenzellen verdauen oder ausstoßen, während sie wachsen und sich teilen [ 1, 11]. Die Vertreibung von Symbionten kann jedoch auch als Reaktion auf ungünstige Bedingungen erfolgen, die eine metabolische Instabilität innerhalb des Symbionten, des Wirts oder beider Partner verursachen. Dies zeigt sich an der Vielzahl von Umwelteinflüssen, die die Ausstoßrate erhöhen, darunter niedrige [12] oder hohe Temperaturen und/oder viel Licht [13,14,15], Dunkelheit [16], erhöhte Verfügbarkeit von gelöstem organischem Kohlenstoff wie z B. Glukose [17], Phosphatbegrenzung [18] und verringerter Salzgehalt [19]. Der übermäßige Verlust von Symbionten und ihrer photosynthetischen Pigmente aus dem Korallengewebe, ein Prozess, der als „Bleichen“ bekannt ist, ist für die Koralle oft tödlich, da sie ihren Stoffwechsel nicht aufrechterhalten kann, ohne die von ihren symbiotischen Algen produzierte Energie zu erhalten. In den letzten Jahrzehnten ist die durch hohe Temperaturen verursachte Bleiche zu einem Hauptgrund für den Rückgang der Riffgesundheit und -ausdehnung auf der ganzen Welt geworden [20]. Trotz fundierter Kenntnisse über die Umweltfaktoren, die das Bleichen auslösen, ist wenig über den zellulären Auslöser für die Verschlechterung der Korallensymbiose und auch nicht bekannt, von welchem ​​Partner der Auslöser stammt.

In eukaryotischen Zellen kann eine metabolische Instabilität bei physiologischem Stress aufgrund eines Ungleichgewichts zwischen der Produktion durch Stoffwechselprozesse und der Löschung zu einem erhöhten Gehalt an reaktiven Sauerstoffspezies (ROS) in der Zelle führen [21]. Wenn ROS nicht ordnungsgemäß kontrolliert werden, können sie durch Oxidation von DNA, Proteinen und Lipiden Schäden an internen Zellkomponenten verursachen [22], was in extremen Fällen zu Apoptose und Zelltod führt. Aufgrund der oft hohen Licht- und Temperaturumgebung des Riffs ist die Photosynthesemaschinerie besonders anfällig für die Produktion und Beschädigung von ROS [23]. Aus diesem Grund ist die Rolle des symbiontischen photosynthetischen Stresses bei der Verschlechterung der Korallensymbiose seit langem ein Hauptschwerpunkt der Korallenbleicheforschung [14, 24, 25, 26], wobei überschüssige ROS vorgeschlagen wurden, die im hitzegeschädigten Photosystem erzeugt werden in die Wirtszelle eindringen und den Zusammenbruch der Symbiose einleiten [27, 28]. Die Beteiligung von ROS am hitze- und lichtinduzierten Bleichprozess wurde durch zahlreiche Studien verstärkt, die korrelative Beobachtungen einer erhöhten zellulären ROS-Schädigung und/oder Antioxidantien im Symbionten und Wirt mit zunehmender Symbiontenausstoßung zeigten [15, 29, 30]. Jüngste Studien haben jedoch den Ursprung von ROS in Frage gestellt, da Hinweise darauf hinweisen, dass ROS eine Rolle spielen, die in der Wirtszelle selbst produziert wird [31, 32]. Wichtig ist, dass die Vielfalt der beobachteten Reaktionen eine Vielzahl möglicher Wege aufzeigt, die zum Zusammenbruch der Symbiose führen, was wahrscheinlich von der Widerstandsfähigkeit jedes Partners gegenüber verschiedenen Stressfaktoren abhängt.

In der vorliegenden Studie wollten wir die mögliche Rolle der Stoffwechselinstabilität bei der Austreibung endosymbiotischer Algenzellen aus dem Korallengewebe untersuchen. Wir untersuchten den Peroxidationsgrad einzelner Lipidkörper als Maß für die übermäßige ROS-Produktion und damit für die metabolische Instabilität in Korallenendosymbionten und ex-symbiotischen Zellen (Algenzellen im Korallengewebe, aber nicht in einer Wirtsmembran eingeschlossen). Lipidperoxidation (LPO) und die Bildung von Lipidhydroperoxiden sind eine häufige Folge erhöhter zellulärer ROS. Aus diesem Grund gilt LPO als empfindlicher Indikator für ROS-Schäden in lebenden Zellen. Wir fanden heraus, dass der Grad der Peroxidation von Lipidkörpern in den endosymbiotischen Algenzellen im Vergleich zu Ex-Symbionten höher war und dass Hitzestress zu einem Rückgang des Anteils von Endosymbionten mit hohem LPO-Gehalt führte, was darauf hindeutet, dass ein hoher LPO-Wert ein Zeichen für eine aktive Symbiose ist. Basierend auf diesen Erkenntnissen argumentieren wir, dass das Verhältnis von LPO zur Lipidakkumulation in endosymbiotischen Korallenalgen ein starker Indikator für den Zustand der Symbiose ist und dass dieser Stoffwechselmarker in zukünftigen Studien zur Untersuchung wichtiger Merkmale des Zusammenbruchs der Symbiose verwendet werden kann.

Fragmente von vier einzelnen Kolonien der verzweigten Korallen Pocillopora acuta, Porites compressa und Montipora capitata (ca. 15 cm Durchmesser) wurden aus der Riffebene (mindestens 10 m voneinander entfernt, ca. 1 m Tiefe) vor Coconut Island (Moku o Loʻe) gesammelt ) in der Kaneohe Bay, Oahu, Hawaii. Die Korallen wurden (als ganze Fragmente) für die Dauer der Studie in abgedeckten (50 % schattigen Stoffen), Outdoor-Durchflusstischen (Volumen ~130 l, Tiefe ~15 cm) mit kontinuierlicher Versorgung mit Buchtwasser (~5 cm) gehalten L min−1). Während der Studie im Mai 2018 lag die Wassertemperatur in der Bucht zwischen 23,5 und 25,5 °C (http://www.pacioos.hawaii.edu/weather/obs-mokuoloe/).

Einzelne Korallenfragmente (ca. 2 cm Länge) wurden unmittelbar vor der Verarbeitung und Analyse aus ihrer jeweiligen Mutterkolonie herausgeschnitten. Um die Konsistenz des physiologischen Zustands (dh des Tagesstadiums) der Korallenkolonien sicherzustellen, wurden die Proben zwischen 12 und 14 Uhr entnommen. Alle Fragmente wurden wie zuvor beschrieben für die Fluoreszenzanalyse verarbeitet [33]. Kurz gesagt, das Korallenfragment wurde in ein 50-ml-Falcon-Röhrchen mit 3 ml gefiltertem Meerwasser gegeben und gegen eine harte Oberfläche geschlagen, um Gastrodermzellen freizusetzen (siehe Lit. [33] und SI für weitere Einzelheiten zu dieser Extraktionsmethode). Anschließend wurden 1,5 ml der resultierenden Gewebeaufschlämmung in ein Eppendorf-Röhrchen überführt und vorsichtig zentrifugiert (~30 RCF für 30 s), gefolgt von der Entfernung des Überstands und der Resuspension in 1,0 ml 0,2 µm gefiltertem Meerwasser (FSW). Nach einem zweiten Waschvorgang wie beschrieben wurden die verbleibenden Zellen in 0,5 ml FSW resuspendiert und mit Fluoreszenzfarbstoff (Image-iT® Lipid Peroxidation Kit, ThermoFisher Scientific, USA) bis zu einer Endkonzentration von 10 µM versetzt. Die Inkubation erfolgte im Dunkeln für 20 Minuten in einem Kulturschrank bei 25 °C. Abschließend wurden die Zellen zweimal in FSW gewaschen, um überschüssigen Farbstoff zu entfernen, vorsichtig abzentrifugiert (~30 RCF für 30 s) und in 50 µL FSW resuspendiert und sofort auf dem konfokalen Mikroskop analysiert. Zu den Zielzellen gehörten „ex-symbiotische“ Algenzellen, d. um die visuelle Identifizierung einzelner ex-symbiotischer Zellen während der Bildverarbeitung zu erleichtern.

Um zu überprüfen, ob die Lipidprofile der aus dem Korallengewebe extrahierten Ex-Symbionten denen vollständig ausgestoßener Algenzellen entsprachen, wurden ausgetriebene Algenzellen aus der Hartkoralle Pocillopora acuta durch kurzzeitige Wärmebehandlung von drei Kolonien gewonnen. Die Kolonien wurden in einem Aquarium (50 l) platziert, das innerhalb des Durchflusstisches positioniert war, der für die Korallenpflege verwendet wurde (stromabwärts der zu pflegenden Korallen), um ein ähnliches Lichtfeld wie die Kontrollen sicherzustellen. Das Wasser im Aufbereitungstank wurde kontinuierlich mit frischem Meerwasser (~1 L min−1) aufgefüllt und über 3 Tage mit zwei 30-W-Aquarienheizern auf ~30 °C erhitzt (~1,5 °C/Tag). Ausgestoßene Symbiontenzellen wurden gesammelt, indem jedes Korallenfragment in 0,4-l-Kunststoffbecher gegeben wurde, die vorgewärmtes, 0,2 µm gefiltertes Meerwasser enthielten. Die Becher wurden 3 Stunden lang in das Behandlungsaquarium geschwommen, danach wurden die Korallenfragmente entfernt und das Wasser durch leichtes Vakuum auf einzelnen 5-µm-Filtern filtriert. Die gefilterten Zellen wurden sofort in 4 ml gefiltertem Meerwasser resuspendiert und zur Fluoreszenzfärbung wie oben beschrieben zentrifugiert.

Die Auswirkung von Hitzestress auf die LPO von Lipidspeichern in Endo- und Ex-Symbionten wurde auf der Grundlage von Daten einer separaten Studie untersucht, die ebenfalls am Hawaii Institute of Marine Biology (HIMB) durchgeführt und bereits veröffentlicht wurde [33]. Für die vorliegende Studie wurden die Daten mit der gleichen Methodik wie für die neuen Daten (siehe unten) erneut analysiert und werden hier mit bisher nicht beschriebenen Details und in einem neuen Kontext präsentiert. Eine detaillierte Darstellung der Probenahme-, Wartungs- und Bildgebungsmethodik für die vorherige Studie finden Sie bei Nielsen et al. [33] und das zugehörige SI. Kurz gesagt, drei Kolonien von Pocillopora acuta wurden aus der Riffebene (~1 m Tiefe) um Coconut Island in der Kaneohe Bay, Oahu, Hawaii gesammelt und in schattigen, durchströmten Mesokosmen gehalten (Volumen: 3 m3, Durchfluss: ~180 l/h). 1, Licht: Mittags max. ~400 µmol Photonen m−2 s−1, natürlicher Tag-Nacht-Lichtzyklus). Ein Satz Korallenfragmente wurde gekühlt, um die Temperatur unter 27 °C zu halten, während ein zweiter Satz einer täglichen Erwärmung (natürlich schwankender Tag-Nacht-Zyklus von 27 °C bis 31 °C) ausgesetzt wurde, die sich über die dreiwöchige Inkubation ergab zu einer Verringerung der Gewebesymbiontendichte um ca. 50 % (Bleichen). Inkubation, Probenahme und Analyse der Zellen wurden wie für die vorliegende Studie beschrieben durchgeführt.

Der ratiometrische Fluoreszenzfarbstoff Image-IT™ basierend auf dem Reagenz BODIPY® 581/591 C11 wurde verwendet, um den Peroxidationszustand von Lipidkörpern in den Algenzellen zu erfassen. Nach Angaben des Herstellers lokalisiert das Reagenz alle Lipidmembranen und zeigt bei Oxidation durch Lipidhydroperoxide eine Verschiebung der Peak-Fluoreszenzemission (reduzierte Lipide ex/em: 581/590, oxidierte Lipide ex/em: 488/510). Der Farbstoff bindet stark innerhalb der Zelle, ist pH-unempfindlich und sehr lichtstabil [34]. Gefärbte Zellen wurden mithilfe konfokaler Fluoreszenzmikroskopie (LSM 710, Zeiss, Oberkochen, Deutschland) analysiert, die mit einer temperaturgesteuerten Umgebungskammer (Incubator Xl S Examiner, Zeiss, Oberkochen, Deutschland) ausgestattet war, wie zuvor beschrieben [33]. Endosymbiotische Gastrodermzellen, die zwei Algensymbionten (zur einfachen Identifizierung) und Ex-Symbionten (nicht symbiotisch, aber immer noch im Korallengewebe) enthielten, wurden visuell im Hellfeld lokalisiert und anschließend bei 630X abgebildet (Zeiss Plan-Apochromat 63×/1,40 Oil DIC M27-Objektiv). ). Die Fluoreszenzbildgebung wurde unter Verwendung von 561-nm- und 488-nm-Lasern zur Anregung von reduziertem bzw. oxidiertem Lipid mit festen Sammelbereichen und Laserintensitäten durchgeführt (Lochgröße: 1,51 AU, Bildauflösung: 512 × 512 px [135 × 135 μm], Pixelverweildauer 1,58 μs, keine Mittelung, Z-Dicke ~1,0 μm. Bei Fluoreszenzfärbungen wurde die Belichtungszeit angepasst, um die Autofluoreszenz in allen Fluoreszenzkanälen unter Verwendung ungefärbter Kontrollzellen zu minimieren. In allen Fällen war die Autofluoreszenz im Vergleich zur Intensität der Fluoreszenzfärbung vernachlässigbar.

Der Nachweis, die Quantifizierung und die Fluoreszenzmessungen von Lipidkörpern in jeder Zelle wurden mithilfe eines benutzerdefinierten Makros in ImageJ/Fiji [35, 36] durchgeführt (ausführliche Beschreibung der Methode siehe SI). Alle extrahierten Bilddaten wurden mit R [37] analysiert. Das Fluoreszenzverhältnis (oxidiert/reduziert) jedes Lipidkörpers wurde berechnet und das durchschnittliche Fluoreszenzverhältnis aller Lipidkörper in jeder Zelle für weitere Analysen verwendet. Durch die Verwendung eines ratiometrischen Ansatzes wurde jede mögliche Verzerrung der Messungen aufgrund von Schwankungen der Farbstoffkonzentration innerhalb der Zelle oder des Lipidkörpers eliminiert. Eine Schätzung des gesamten Lipidkörpervolumens pro Zelle wurde als Summe der Fläche aller Lipidkörper-ROIs innerhalb einer Zelle multipliziert mit der Fokusdicke der Bildschicht (~1 µm) erstellt. Bei endosymbiotischen Zellen wird der Durchschnitt der beiden Zellen innerhalb einer Gastrodermzelle als eine Messung dargestellt. Die großen, runden und stark fluoreszierenden Einschlusskörper, die manchmal in Algen-Symbiontenzellen vorkommen, wurden mithilfe fester Größenbereiche und Fluoreszenzverhältnis-Grenzwerte basierend auf manueller Kuration aus dem Datensatz ausgeschlossen.

Alle Analysen wurden mit R Statistical Software (v4.1.2; R Core Team 2021) durchgeführt. Da der Schwerpunkt dieser Studie darauf lag, physiologische Veränderungen zwischen Zelltypen innerhalb von Korallenarten zu verstehen, um die Muster zwischen den Arten besser vergleichen zu können, wurden alle Daten auf den Mittelwert der Werte der jeweiligen endosymbiotischen Zellen für jede Art normalisiert. Die Vergleichsdaten wurden mit dem Shapiro-Wilk- bzw. Levene-Test auf Normalität und Homoskedastizität überprüft. Daten, die die Annahmen nicht erfüllten, wurden logarithmisch oder quadratwurzeltransformiert und die Normalverteilung mithilfe von qqplot überprüft, bevor statistische Tests durchgeführt wurden. Unterschiede zwischen Zelltypen wurden mit linearen Mixed-Effect-Modellen auf mittlere Koloniewerte und Kolonie als Zufallsfaktor unter Verwendung der lmer-Funktion aus dem R-Paket „lme4“ [38] analysiert, wobei die Parameter mithilfe der eingeschränkten maximalen Wahrscheinlichkeit (REML) geschätzt wurden. Für Analysen mit mehreren Gruppen wurden ANOVA-Tabellen für Terme mit festen Effekten mit der Satterthwaite-Methode für Nenner-Freiheitsgrade und F-Statistik mithilfe der Anova-Funktion im R-Paket lmerTest generiert [39]. Die Daten wurden bei P < 0,05 als signifikant angesehen. Die Clusteranalyse wurde unter Verwendung des K-Means-Algorithmus (Euklidischer Abstand) aus dem R-Paket-„Cluster“ durchgeführt [40]. Die optimale Anzahl von Clustern wurde mithilfe von „Total Within Sum of Squares“, „Silhouette“ und „Gap Statistic“ mit 100 Monte-Carlo-Bootstrap-Stichproben unter Verwendung der Funktion fviz_nbclust aus dem R-Paket „factoextra“ bewertet [41].

Aufgrund der stark lipophilen und ratiometrischen Natur des verwendeten Lipidperoxidations-empfindlichen Farbstoffs [34] konnten wir mithilfe der konfokalen Fluoreszenzmikroskopie den Grad der Peroxidation messen und das Gesamtvolumen der Lipidspeicher (oxidiert und reduziert, kombiniert) beurteilen. innerhalb einzelner Algenzellen. Während andere Lipidmembranen möglicherweise näher am Ursprung der ROS-Produktion liegen und daher anfälliger für Peroxidation sind als Lipidspeicherkörper, wie beispielsweise die in den Thylakoiden der Chloroplasten, haben wir uns aufgrund ihrer räumlichen Lage für die Beurteilung von LPO auf Lipidkörper konzentriert diskrete Natur und ein starkes Signal des Fluoreszenzfarbstoffs, was eine klare Abgrenzung während der Bildverarbeitung und damit eine hohe Empfindlichkeit unserer Messungen ermöglicht.

Ähnlich wie bei den Ergebnissen unserer vorherigen Studie über die Hartkoralle Acropora millepora [42] stellten wir fest, dass ex-symbiotische Zellen (d. h. nicht-symbiotische) im Vergleich zu ihren endosymbiotischen Gegenstücken im Durchschnitt größere Mengen an Lipid (als Lipidkörper) enthielten ( M. capitata: T(4) = 2,97, P = 0,041; P. compressa: T(2) = −20,74, P = 0,0023; P. acuta: T(4) = −6,32, P = 0,0032). Während in dieser Studie nur Wirtszellen mit zwei Endosymbionten zur Analyse einbezogen wurden, zeigten Endosymbionten in Wirtszellen mit einem Symbionten ein ähnliches Lipidprofil wie Zellen mit doppeltem Endosymbionten (ergänzende Abbildung S1 und zugehörige Ergebnisse), was den beobachteten niedrigen Lipidgehalt in Endosymbionten bestätigt in den präsentierten Daten war nicht das Ergebnis einer kürzlich erfolgten Teilung der Algenzellen im Gastland und die Zellen, die wir als „Ex-Symbionten“ bezeichneten, waren keine Algenzellen, die während der Verarbeitung mechanisch aus ihrer Wirtszelle herausgebrochen wurden. Um weiter zu verifizieren, dass die ex-symbiotischen Zellen repräsentativ für aus der Korallenkolonie ausgestoßene Zellen waren, verglichen wir die Lipidprofile von ex-symbiotischen Zellen mit ausgestoßenen Zellen, die aus denselben Kolonien von Pocillopora acuta stammen (ergänzende Abbildung S2 und zugehörige Ergebnisse). Diese Daten bestätigten, dass das Lipidprofil der Ex-Symbionten sowohl hinsichtlich des Lipidgehalts als auch des LPO-Verhältnisses dem von Zellen ähnelte, die aus der Wirtskoralle ausgestoßen worden waren. Schließlich fanden wir eine starke negative Korrelation zwischen dem Lipidgehalt und der Fluoreszenz der Symbiosomenmembran (R2 = 0,37, P <0,0001, ergänzende Abbildung S3 und zugehörige Ergebnisse), was bestätigt, dass der Verlust der symbiotischen Beziehung mit einem erhöhten Lipidgehalt korreliert. Aufgrund dieser Daten sind wir davon überzeugt, dass es sich bei den im Korallengewebe gefundenen ex-symbiotischen Algenzellen um Algen in einem post-symbiotischen Zustand handelt, die gerade aus der Korallenkolonie vertrieben werden.

Entgegen den Erwartungen stellten wir fest, dass endosymbiotische Algenzellen unter Bedingungen ohne Umweltstress höhere LPO-Werte in ihren Lipidkörpern aufwiesen (dargestellt als Verhältnis von peroxidiertem zu nicht peroxidiertem Lipid) als ex-symbiotische Zellen. Dieser Unterschied war bei allen drei Arten konsistent: M. capitata (T(2) = −4,852, P = 0,040), P. compressa (T(2) = −43,391, P = 0,00053) und P. acuta (T(2). ) = −5,972, P = 0,0094) (Abb. 1c, d), was bestätigt, dass dieses Muster in einer Reihe phylogenetisch unterschiedlicher Korallenarten erhalten bleibt. Diese Daten legen nahe, dass endosymbiotische Algenzellen einem höheren ROS-Druck pro Lipidkörper ausgesetzt sind als solche, die aus dem Wirt ausgestoßen wurden oder werden. Bei einem bestimmten Niveau des ROS-Drucks (ähnliche Stoffwechselaktivität oder Stress) würden wir erwarten, dass eine Zelle mit geringeren Lipidspeichern pro Lipidmolekül stärker oxidiert wird als eine Zelle mit größeren Lipidspeichern, allein aufgrund eines höheren ROS zu Lipid Verhältnis, was zumindest teilweise den hier beobachteten Unterschied im LPO zwischen dem Symbiontenstatus erklären könnte. Beim Vergleich der Beziehung zwischen Lipidvolumen und LPO-Verhältnissen innerhalb von Zelltypen mithilfe verallgemeinerter Modelle der kleinsten Quadrate enthielt das Modell mit der besten Bewertung (niedrigster BIC) jedoch sowohl Lipidvolumen als auch Zelltyp als Prädiktorvariablen (siehe Ergänzungstabelle S3), was darauf hinweist, dass die Die Beziehung zwischen Lipidgehalt und LPO-Verhältnis war bei beiden Zelltypen unterschiedlich, wobei endosymbiotische Zellen bei ähnlichem Lipidvolumen einen höheren LPO aufwiesen (ergänzende Abbildung S4 und zugehörige Ergebnisse). Basierend auf diesen Ergebnissen und angesichts der Tatsache, dass diese Daten unter harmlosen Umweltbedingungen gewonnen wurden, schlagen wir vor, dass der in den Endosymbionten beobachtete höhere LPO-Spiegel nicht auf eine stressbedingte ROS-Produktion zurückzuführen ist, sondern auf ROS, die im Rahmen des allgemeinen Stoffwechsels produziert werden Aktivität der Zelle (Atmung und Photosynthese) – die in Symbiose wahrscheinlich höher wäre, da die Algenzelle daran arbeitet, den Stoffwechselbedarf ihrer Wirtszelle zu decken. Diese Annahme wird durch unsere früheren Arbeiten gestützt, in denen gezeigt wurde, dass Hitzestress die Photosynthesekapazität endosymbiotischer Algen in der Steinkoralle Acropora millepora verringert [42] und die Menge an Proteinen verringert, die mit dem Energiestoffwechsel in den Symbionten verbunden sind [43]. In seltenen Fällen (~0,5 % der beobachteten Zellen) wurde festgestellt, dass eine Wirtszelle zwei Symbionten mit deutlich unterschiedlichen LPO-Werten enthielt; wobei ein Symbiont ein ähnliches Stoffwechselprofil wie ein Ex-Symbiont aufweist (siehe ergänzende Abbildung S5c). Das geringe Vorkommen dieser Zellen mit dualem LPO-Profil kann dadurch erklärt werden, dass die Wirtszelle eine Verschiebung in der Physiologie eines Symbionten erkennt – oder durch den Symbionten induziert wird und diesen Symbionten schnell ausstößt, was dieses duale Szenario nur von kurzer Dauer und damit zu einer Herausforderung macht erfassen. Alternativ kann es sein, dass sich mehrere Algenzellen innerhalb einer gemeinsamen Wirtszelle im Allgemeinen häufiger im gleichen physiologischen Zustand befinden. Derzeit ist jedoch nicht bekannt, ob der Wirt einzelne Symbionten selektiv vertreiben kann.

ein Lipidvolumen im Verhältnis zum Mittelwert ihrer jeweiligen Endosymbionten, überlagert mit dem mittleren Koloniewert (braune Formen). b Dichtediagramm des Lipidvolumens aller endosymbiotischen (weißer Bereich) bzw. ex-symbiotischen Zellen (grauer Bereich). c Lipidperoxidationsverhältnis im Verhältnis zum Mittelwert ihrer jeweiligen Endosymbionten, überlagert mit dem mittleren Koloniewert. d Dichtediagramm des Lipidperoxidationsverhältnisses aller endosymbiotischen (weißer Bereich) bzw. ex-symbiotischen Zellen (grauer Bereich). Beispielbilder (maximale Projektion konfokaler Bildstapel) von Endo- und Ex-Symbionten jeder Art. Die weiße Linie zeigt eine Größe von ~10 µm an. Rot: Chlorophyll-Autofluoreszenz von Algenzellen; Gelb: Lipidkörper mit niedrigem LPO-Verhältnis (grün/gelb). Fehlerbalken zeigen 1 SE an. Sterne geben das Signifikanzniveau für den Gruppenvergleich an (n = 3–5) (* P < 0,05; ** P < 0,01; *** P < 0,001).

Die Rolle von LPO in Korallensymbionten ist derzeit nicht bekannt. Es hat sich gezeigt, dass die kontrollierte Lipidperoxidation über Enzyme wie Lipoxygenase (LOX) und Cyclooxygenase (COX) zur Mobilisierung von Lipidspeichern in Pflanzenembryonen und Keimblättern beiträgt, indem sie den Zugang zu den gespeicherten Esterlipiden in Lipidkörpern ermöglicht und so Fettsäuren freisetzt, die anschließend verstoffwechselt werden können durch β-Oxidation in den Mitochondrien [44,45,46]. Somit könnte LPO die Freisetzung von Kohlenstoff aus den Lipidkörpern zur Übertragung auf den Wirt während der aktiven Symbiose erleichtern. Kürzlich wurde außerdem vermutet, dass von Symbionten abgeleitete Oxylipine, wichtige Signalmoleküle, die durch enzymatische Peroxidation mehrfach ungesättigter Fettsäuren entstehen, eine Rolle bei der Aufrechterhaltung der Korallensymbiose spielen könnten, indem sie direkt Veränderungen in der Genexpression des Wirts auslösen [47]. Allerdings müssen solche Verbindungen zu LPO in Korallensymbionten noch untersucht werden.

Eine eindeutige Gruppierung des Lipidstatus der Algenzellen wurde durch eine Clusteranalyse bestätigt, bei der drei Cluster mit einer prozentualen Verteilung von (endo:ex) 90:10, 34:66 und 0:100 innerhalb der Cluster 1, 2 bzw. 3 (grün) erkannt wurden , blau und rot; Abb. 2). Basierend auf der beobachteten Gruppierung nehmen wir an, dass Cluster Nr. 1 hauptsächlich aktive endosymbiotische Algen darstellt und Cluster Nr. 3 ausgestoßene, aber physiologisch aktive Zellen darstellt, während Cluster Nr. 2 aus Zellen besteht, die entweder sterben (geringer Lipidgehalt und niedriger LPO) oder sterben befinden sich im physiologischen Zwischenzustand, der unmittelbar vor oder nach der Austreibung vorliegt.

Die Diagrammfarben zeigen Gruppen an, die über Kmeans-Clustering identifiziert wurden (grün: Cluster 1 „endosymbiotisch“; blau: Cluster 2 „Übergang“; orange: Cluster 3 „ex-symbiotisch“). Formen geben den Zelltyp an (Kreis: Endosymbiotikum, Quadrat: Ex-Symbiotikum). Kreisdiagramme zeigen das Verhältnis von endosymbiotischen (endo) gegenüber ex-symbiotischen (ex) Algenzellen innerhalb jedes Clusters; Zahlen geben die Gesamtzahl der Zellen jedes Zelltyps an.

Um die Gültigkeit dieser Annahmen zu beurteilen, analysierten wir Daten aus einem früheren Hitzestressexperiment an Pocillopora acuta [33]. Diese Daten zeigten die gleiche Beziehung zwischen LPO und Lipidgehalt wie in der vorliegenden Studie (siehe ergänzende Abbildung S6 und zugehörige Statistiken), wobei das Gesamtlipidvolumen pro Zelle bei Ex-Symbionten größer war, während die LPO-Verhältnisse deutlich niedriger waren, was dies weiter bestätigt Konstanz dieses Musters. Interessanterweise stieg der LPO bei Hitzestress nicht an, was die Hypothese stützt, dass der Unterschied im LPO zwischen Endosymbionten und Ex-Symbionten nicht durch stressbedingte ROS-Produktion verursacht wird, zumindest nicht bei P. acuta. Mithilfe einer Clusteranalyse an einzelnen Zellen stellten wir fest, dass Hitzestress die Anzahl der endosymbiotischen Zellen im Lipidprofil von Cluster 1 kontinuierlich verringerte (Abb. 3, siehe auch ergänzende Abb. S7 für die Darstellung einzelner Replikatkolonien), was die Hypothese dieses Clusters stark stützt 1 stellt gesunde oder nicht gestresste Zellen in Symbio dar. In einer aktuellen Studie haben wir herausgefunden, dass Hitzestress zu einer Verringerung des Anteils wichtiger Proteine ​​führt, die mit der Energieproduktion in den Symbionten der Koralle Acropora milllepora verbunden sind [43]. Eine Verringerung des Energiestoffwechsels führt wahrscheinlich auch zu einer Verringerung der allgemeinen ROS-Produktion, was die hier beobachtete Verringerung des Anteils von Endosymbionten mit hohem LPO-Gehalt erklären könnte. Diese Daten deuten auch darauf hin, dass gesunde Endosymbionten metabolisch aktiver sind und daher möglicherweise den Abfall des LPO beim Übergang vom endosymbiotischen in den ex-symbiotischen Zustand erklären, auch ohne Beteiligung von Umweltstress. Während hier nur Hitzestress als Auslöser der Verschiebung des LPO- und Lipidgehalts endosymbiotischer Zellen getestet wurde, lässt der deutliche Unterschied, der zwischen endo- und ex-symbiotischen Zellen in gesunden Korallen beobachtet wurde, darauf schließen, dass die Reaktion wahrscheinlich allgemeiner Natur ist Materie ist die Ursache für Stoffwechselveränderungen. Dies muss jedoch noch untersucht werden. Die Bedeutung von Lipiden in der Korallensymbiose wurde in einer früheren Studie an der Koralle Euphyllia glabrescens hervorgehoben [48], in der gezeigt wurde, dass das Ausmaß der Ansammlung von Lipidkörpern in den gastrodermalen Zellen und Endosymbionten des Wirts mit der scheinbaren Gesundheit der Symbiose korreliert. wie durch Hitzestress moduliert. Unsere Studie unterstützt und fördert diese Beobachtungen, indem sie zeigt, dass das Muster der Lipidkörperakkumulation und des LPO in Endosymbionten als Indikator für den bevorstehenden Zusammenbruch der symbiotischen Interaktionen auf zellulärer Ebene verwendet werden kann. Der Grund für die Ansammlung von Lipiden bis und/oder nach dem Zusammenbruch der Symbiose ist unbekannt. Frühere Studien haben jedoch gezeigt, dass das Vorhandensein eines unbekannten Wirtsfreisetzungsfaktors dazu führt, dass die Algen ihre Glycerinproduktion steigern, indem sie überschüssigen Kohlenstoff von Speicherverbindungen ableiten [49,50,51]. Wenn die symbiotische Beziehung zusammenbricht, könnte das Verschwinden dieses Wirtsfreisetzungsfaktors den Symbionten dazu veranlassen, überschüssigen Kohlenstoff stattdessen als Lipid anzusammeln. Eine aktuelle Studie legt nahe, dass eine erhöhte Stickstoffversorgung des Symbionten vom Wirt im Vorfeld des Zusammenbruchs der Symbiose zu einer Verschiebung der Stoffwechselpriorität des Symbionten hin zu Wachstum und Zellteilung führt [52]. Bei einer Erhöhung der Stickstoffversorgung ist es denkbar, dass die daraus resultierende Verringerung des C:N-Verhältnisses den Symbionten dazu veranlasst, überschüssigen Kohlenstoff festzuhalten, der für weiteres Wachstum nützlich sein kann, was zu einer Erhöhung der Menge an Kohlenstoff führt, die als Lipidkörper im Symbionten gespeichert wird Zelle. Andererseits wurde auch gezeigt, dass Algenzellen, einschließlich freilebender Symbiodinium, die Lipidspeicherung erhöhen, wenn eine Stickstofflimitierung auftritt [53], die wahrscheinlich nach dem Ausstoß aus der Wirtszelle eintreten würde. Wie auch immer, die Zunahme der Lipidkörper innerhalb der Algenzelle scheint auf einen Verlust des symbiotischen Status hinzudeuten und stützt frühere Beobachtungen eines Zusammenhangs zwischen Symbiose und Lipogenese in den Algen.

Die Formen weisen auf eine Koloniereplikation hin. Rohdaten von Nielsen et al. [33]. Cluster identifiziert und gefärbt wie in Abb. 2. Nur endosymbiotische Zellen sind gefärbt, wobei ehemalige symbiotische Zellen als graue, offene Symbole dargestellt sind. Balkendiagramme zeigen den Anteil endosymbiotischer Zellen in jedem Cluster.

Basierend auf den präsentierten Ergebnissen schlagen wir vor, dass Korallenendosymbionten im Vergleich zu ausgestoßenen Symbionten aufgrund der vergleichsweise höheren Stoffwechselaktivität und geringeren Lipidspeicher einen hohen Anteil an Lipidkörper-LPO aufweisen. Entgegen der Erwartung war LPO unter den getesteten Bleichbedingungen kein Indikator für Stress und stellt ein weiteres Beispiel für Korallenbleiche dar, die unabhängig von einer übermäßigen ROS-Produktion auftritt. Unsere Ergebnisse legen nahe, dass ein verringerter LPO zusammen mit einem Anstieg der Lipidspeicher ein robuster Indikator für Veränderungen im Stoffwechselprofil von Korallenendosymbionten und ein nützlicher zellulärer Indikator für den bevorstehenden Zusammenbruch der Korallensymbiose ist. Durch die Überprüfung dieses Musters an drei entfernt verwandten Korallenarten zeigen wir, dass diese Beobachtungen eine breite phylogenetische Relevanz haben und somit einen allgemein anwendbaren Stoffwechselmarker zur Charakterisierung des Zustands der Korallensymbiose darstellen könnten. Die Kombination aus Einzelzellmessungen und Clusteranalyse ergab eine kleine, aber deutliche Verschiebung im Anteil der Zellen mit einem bestimmten Stoffwechselprofil in P. acuta, die auf Hitzestress zurückzuführen sein könnte. Solch ein subtiler Effekt wird bei Massengewebeanalysen leicht übersehen und konnte tatsächlich nicht in den mittleren Koloniereaktionen nachgewiesen werden, was die Stärke und Bedeutung der Einzelzellarbeit für die Aufdeckung wichtiger physiologischer Mechanismen der Korallen-Algen-Symbiose unterstreicht. Zusammen mit den jüngsten Fortschritten bei Gewebekulturtechniken für das Wachstum und den Erhalt einzelner symbiotischer und nicht-symbiotischer Korallenzellen [7] bietet dieser neue Marker eine spannende Gelegenheit für die Untersuchung der Mechanismen, die der Aufrechterhaltung und dem Zusammenbruch der Korallensymbiose zugrunde liegen.

Die während der aktuellen Studie generierten und/oder analysierten Datensätze sind auf begründete Anfrage beim jeweiligen Autor erhältlich. Daten für Abbildungen im Manuskript sind in den ergänzenden Materialien data.xlsx enthalten.

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Dieses Projekt wurde durch ein PADI-Stipendium (28569) unterstützt, das KP gewährt wurde. Korallen wurden im Rahmen der US-amerikanischen Sondergenehmigungen 2016-55 und 2019-23 gesammelt. Die Autoren danken der verstorbenen Prof. Ruth Gates, die diese Forschung am Hawai'i Institute of Marine Biology (HIMB) gesponsert hat.

School of Life Sciences, University of Technology Sydney, Ultimo, NSW, Australien

Daniel Aagren Nielsen & Katherina Petrou

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Konzeptualisierung, Methodik, Untersuchung: DAN, KP; Formale Analyse, Visualisierung, Schreiben – Originalentwurfsvorbereitung: DAN; Schreiben – Rezension und Bearbeitung: DAN, KP; Finanzierungseinwerbung, Ressourcen: KP.

Korrespondenz mit Daniel Aagren Nielsen.

Die Autoren geben an, dass keine Interessenkonflikte bestehen.

Anmerkung des Herausgebers Springer Nature bleibt hinsichtlich der Zuständigkeitsansprüche in veröffentlichten Karten und institutionellen Zugehörigkeiten neutral.

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Nachdrucke und Genehmigungen

Nielsen, DA, Petrou, K. Lipidspeicher offenbaren den Zustand der Korallen-Algen-Symbiose auf Einzelzellebene. ISME COMMUN. 3, 29 (2023). https://doi.org/10.1038/s43705-023-00234-8

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Eingegangen: 30. November 2022

Überarbeitet: 14. März 2023

Angenommen: 22. März 2023

Veröffentlicht: 04. April 2023

DOI: https://doi.org/10.1038/s43705-023-00234-8

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